Virus gây bệnh hội chứng đốm trắng (WSSV) và virut stylirostris penstyldenso 1 trên tôm Penaeus (trước đây có tên là bệnh truyền nhiễm hypodermal và virut gây hoại tử ở cơ quan tạo máu IHHNV) là hai trong số các virus gây bệnh quan trọng nhất trên tôm he.
Mục đích của Carlos AG Leal thuộc Đại học Liên bang Lavras, Brazil và các cộng sự là phát triển và chuẩn hóa khảo nghiệm kép qPCR để phát hiện đồng thời virut WSSV và PstDV1 trong các mẫu bệnh lâm sàng trên tôm thẻ L. vannamei.
Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) và virut Penaeus stylirostris penstyldenso 1 (PstDV1) là 2 trong virus gây bệnh trên tôm he và đang đặt ra một mối đe dọa lớn cho nghề nuôi tôm trên toàn thế giới. WSSV có khả năng lây nhiễm cao, lan rộng trên toàn thế giới (có hơn 93 loài động vật chân đốt bị nhiễm bệnh) và được báo cáo ở phần lớn các nước nuôi tôm. Dịch bệnh đốm trắng ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei đặc trưng bởi tỷ lệ tử vong cao, con số lên tới 100% từ 3 đến 10 ngày. Ngược lại, PstDV1 gây bệnh mãn tính ở tôm thẻ L. vannamei hay còn gọi là hội chứng còi (RDS). RDS gây ra dị tật và làm chậm tăng trưởng, dẫn đến hiệu quả sản xuất thấp hơn và làm giảm giá trị thị trường trong mùa vụ thu hoạch từ 10% đến 50%.
Hình 1: lô khuếch đại đường cong tiêu chuẩn của singleplex và qPCR kép.
Một số phương pháp bao gồm cả kiểm tra mô học, kính hiển vi điện tử, lai tạo và phản ứng dây chuyền polymerase (PCR), phương pháp này đã được phát triển để chẩn đoán bệnh đốm trắng và các bệnh nhiễm trùng PstDV1. Xét nghiệm bằng PCR cho thấy thời gian thực để phát hiện WSSV và PstDV1 là hiệu quả nhất. Những phương pháp qPCR đã chứng minh độ nhạy cao hơn so với các phương pháp chẩn đoán thông thường được sử dụng để phát hiện virut trên tôm. Hiện nay có 53 bản thảo khoa học và 11 bằng sáng chế mô tả phương pháp khác nhau để chẩn đoán WSSV theo website cơ sở dữ liệu khoa học ™ (Thompson Reuters, Hoa Kỳ). Tuy nhiên, không có xét nghiệm qPCR sẵn có để phát hiện đồng thời WSSV và PstDV1 trong tôm. Phương pháp kép qPCR cho phép phát hiện đồng thời hai loại virus trong cùng một mẫu với chi phí tối ưu mà hiệu quả lại cao hơn ở mỗi khảo nghiệm riêng rẽ. Điều đặc biệt thú vị trong các cuộc điều tra về dịch tễ, giám sát và các chương trình yêu cầu phân tích số lượng lớn các mẫu. Phương pháp này tốn ít thời gian và không tốn kém, đây là điều rất cần thiết cho tính khả thi về kinh tế và kỹ thuật của các chương trình này, chủ yếu nhận được sự hỗ trợ bởi chính phủ. Ngoài ra, khảo nghiệm qPCR có thể cải thiện việc chẩn đoán các trường hợp đồng nhiễm do WSSV và PstDV1. Đây là một vấn đề ngày càng gia tăng đến an toàn sinh học trong nuôi tôm. Mục đích của nghiên cứu này là để phát triển và chuẩn hóa khảo nghiệm qPCR song song phát hiện đồng thời WSSV và PstDV1 trong các mẫu bệnh lâm sàng trên tôm thẻ L. vannamei. Ngoài ra, để đánh giá hiệu suất của phổ TaqMan PCR Master Mix (TUMM; hệ thống sinh học ứng dụng, Carlsbad, CA, USA) và Virus QuantiTect (QVK; Qiagen, Chatsworth, CA, USA) tổng hợp liên quan đến sự nhạy cảm với xét nghiệm lâm sàng qPCR cũng như các phương pháp khác nhau để đánh giá kết quả của qPCR.
Kết quả
Tiêu chuẩn qPCR
Chúng tôi đã tiêu chuẩn hóa với khảo nghiệm kép qPCR để phát hiện WSSV và PstDV1 trong các mẫu tôm chân trắng nhiễm bệnh lâm sàng. Nồng độ mồi thăm dò tối ưu là 60 pmol cho mỗi lớp sơn lót và 25 pmol dùng thăm dò mỗi phản ứng với các xét nghiệm qPCR singleplex và kép. Không có sự khác biệt trong sự khuếch đại của đường cong chuẩn đã được quan sát giữa duplex và xét nghiệm singleplex (Hình 1), không phụ thuộc vào kết hợp sử dụng. Trung bình (n = 3) hiệu quả của PCR singleplex (WSSV = 91%, PstDV1 = 90%) và song công (WSSV = 91%; PstDV1 = 101%) xét nghiệm được sử dụng các TUMM là tối ưu trong phạm vi đề nghị. Trung bình (n = 3) hiệu quả PCR cho singleplex (WSSV = 96%, PstDV1 = 98%) và song công (WSSV = 109%, PstDV1 = 109%) xét nghiệm được sử dụng hỗn hợp chủ QVK cũng trong phạm vi tối ưu được đề nghị . Các giới hạn phát hiện hai bản sao khi kiểm soát WSSV plasmid và 20 bản PstDV1 kiểm soát plasmid mỗi phản ứng cho cả singleplex và xét nghiệm kép (Hình 1).
Đường cong tiêu chuẩn pha loãng nối tiếp từ 2 × 104-2 kiểm soát bản sao của plasmid cho thấy giới hạn phát hiện của hai bản sao WSSV trong singleplex (A) và định dạng kép (B) và 20 bản sao cho PstDV1 trong singleplex © và định dạng kép Duplex ( D).
Khả năng xuyên tương tác của các mẫu DNA khác nhau và sự can thiệp của nó có hiệu quả trên PCR được đánh giá bằng cách sử dụng 6 × 6 phân tích bàn cờ. Các lô khuếch đại của WSSV và kiểm soát PstDV1 plasmid không bị ảnh hưởng đáng kể trong các hỗn hợp với nồng độ giữa 2 × 101 × 104 và 2 bản sao cho mỗi phản ứng. Với nồng độ cao nhất PstDV1 plasmid (2 x 105 bản sao cho mỗi phản ứng) giới hạn phát hiện của plasmid WSSV tăng từ 2 đến 20 bản. Ngược lại, giới hạn phát hiện của plasmid PstDV1 không bị ảnh hưởng bởi bất kỳ nồng độ thử nghiệm WSSV.
Nhạy cảm lâm sàng
Trong việc đánh giá ngưỡng chu kỳ, không có khác biệt đáng kể (P = 0.9265) độ nhạy lâm sàng hoặc đã được quan sát giữa các xét nghiệm singleplex với WSSV và PstDV1 và xét nghiệm kép sử dụng kết hợp cùng một chủ thể (Bảng 1). Các xét nghiệm TUMM, chứng minh lâm sàng cho độ nhay cao để phát hiện WSSV. Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong độ nhạy để phát hiện PstDV1 đã được quan sát giữa các hỗn hợp TUMM và QVK; với cả hai sản phẩm thể hiện một sự nhạy cảm lâm sàng có tính khả thi để phát hiện PstDV1. Duplex chuẩn qPCR xác nhận sự hiện diện của DNA trong 28 mẫu virus trước đó đã được thử nghiệm dương tính với WSSV hoặc PstDV1. Các giá trị Cq trong khảo nghiệm TUMM thấp hơn so với các xét nghiệm QVK. Giảm trung bình trong các giá trị của Cq 3.11 đã được xác nhận trong các thử nghiệm WSSV singleplex và 4,98 giảm trung bình giá trị Cq được quan sát thấy trong các khảo nghiệm singleplex IHHNV. Xét nghiệm kép TUMM qPCR với WSSV và PstDV1 có giá trị trung bình thấp hơn lần lượt là 2.89 và 4.83 thấp hơn giá trị trung bình Cq tương ứng. Một trường hợp đồng nhiễm đã được xác định.
Bảng 1: Tính nhạy cảm của xét nghiệm lâm sàng qPCR để phát hiện đốm trắng và PstDV1
Việc sử dụng các thuật toán ngưỡng tương đối để phân tích dữ liệu với độ nhạy lâm sàng tăng lên đáng trong phát hiện PstDV1 (P = 0,0026; Bảng 1). Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong độ nhạy để phát hiện WSSV đã được quan sát (P = 1,0). Sử dụng các thuật toán ngưỡng tương đối để phân tích dữ liệu, xét nghiệm QVK singleplex và kép đã chứng minh sự nhạy cảm lâm sàng mức độ cao hơn (100% cho cả hai loại virus) so với xét nghiệm TUMM, so với những cá thể được xác định bằng cách sử dụng thuật toán ngưỡng chu kỳ. Tuy nhiên, với kết quả 13 dương tính giả, 3 dương tính giả với WSSV và 10 dương tính giả cho PstDV1 đã thu được trong thử nghiệm QVK kép qPCR. Không có khác biệt đáng kể trong độ nhạy lâm sàng đã được quan sát giữa singleplex và xét nghiệm kép Dulpex QVK qPCR. Tuy nhiên, việc sử dụng các thuật toán ngưỡng tương đối để phân tích các dữ liệu QVK kép qPCR, giảm độ đặc của phân tích từ 100% đến 43,47%, so với đặc trưng thu được bằng cách sử dụng thuật toán ngưỡng chu kỳ. Tam nhiễm các được xác định trong cả QVK và xét nghiệm kép TUMM Duplex bằng cách sử dụng thuật toán ngưỡng tương đối.
Thảo luận
qPCR kép đã được chuẩn hóa với WSSV và phát hiện trong các mẫu lâm sàng PstDV1 sử dụng mồi và thăm dò đã được xác nhận trước đó. Đặc trưng và nhạy cảm tương tự như của các xét nghiệm singleplex đã thu được bằng cách sử dụng kép ở điều kiện qPCR tối ưu hóa cho phép xác định cả số ít và nhiễm bệnh ở tôm chân trắng. Việc xác định đồng thời của WSSV và PstDV1 rất hữu ích vì nhiễm bệnh trong tôm là phổ biến.
Độ nhạy của phân tích khảo nghiệm qPCR kép tương tự như những singleplex với xét nghiệm WSSV và PstDV1 và các tác giả thu được trong nghiên cứu trước đây. Giới hạn phát hiện IHHNV của Duplex chuẩn qPCR khảo nghiệm tương tự như báo cáo cho một phương pháp multiplex real-time PCR trong một nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên, khảo nghiệm Duplex kép qPCR phát hiện 10 – 627 số lần thấp hơn PstDV1 DNA hơn song thường được mô tả trước đây và phương pháp PCR multiplex. Ngoài ra, giới hạn phát hiện WSSV cho khảo nghiệm kép qPCR ở là 1 lần thấp hơn so với kết quả thu được bằng cách sử dụng phương pháp PCR multiplex mô tả trước đây và 10 bản thấp hơn được sử dụng một phương pháp qPCR multiplex mô tả trước đây. Những dữ liệu này chứng minh hiệu suất cao của hai tiêu chuẩn phương pháp qPCR, so với các phương pháp khác PCRbased thông thường và thời gian thực. Ngoài ra, giới hạn phát hiện thấp hơn tiêu chuẩn xét nghiệm qPCR kép làm cho nó thành một công cụ hữu ích để xác định số lượng virut ở mức lâm sàng trên động vật, chẳng hạn như quan sát trong ấu trùng tôm và hậu ấu trùng, làm giảm khả năng cho kết quả âm tính.
Dữ liệu từ phân tích qPCR thông thường được đánh giá bằng cách sử dụng một phương pháp phù hợp với quan điểm, trong đó sử dụng một ngưỡng cố định dựa trên sự khác biệt về cường độ huỳnh quang đường cơ sở để xác định giá trị Cq ở mỗi mẫu. Hiệu quả qPCR chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố có thể dẫn đến vấn đề xác định số lượng đáng kể. Yếu tố gây nhiễu đặc biệt có liên quan đến việc chuẩn đoán lâm sàng qPCR dựa trên các bệnh động vật thủy sản bởi vì một số chất ức chế có thể làm nhiễm các mẫu DNA từ các mô của một số loài. Mô hình Sigmoidal-fit có thể làm giảm các loại không chính xác bởi vì thuật toán của chúng phân tích từng dòng riêng biệt.
Trong phân tích hiện tại của phương pháp qPCR khác nhau, việc sử dụng các thuật toán ngưỡng tương đối, dựa trên một mô hình Sigmoidal-fit phù hợp giúp cải thiện đáng kể hiệu suất của cả hai singleplex và xét nghiệm Dulpex kép qPCR và sự nhạy cảm lâm sàng đã được tăng từ 40% đến 100%. Chất ức chế qPCR là một vấn đề phổ biến trong chẩn đoán cho động vật giáp xác. Hiệu suất cao của khảo nghiệm kép TUMM qPCR giải quyết vấn đề liên quan đến việc phát hiện WSSV và PstDV1, trong khi giảm kết quả âm tính. Sự pha trộn QVK chứa một sự kết hợp tối ưu của kali clorua, amoni sunfat và một yếu tố tổng hợp tăng cường mồi annealment. Tuy nhiên, điều này cũng có thể gây ủ không đặc hiệu trong một số trường hợp, loại mà kết quả hiện tại và những nghiên cứu trước đây đã xác nhận.
Bằng cách sử dụng khảo nghiệm Duplex kép qPCR, ba trường hợp đồng nhiễm WSSV-PstDV1 đã được xác định, trong đó các loài động vật được trình bày với các dấu hiệu lâm sàng của bệnh chỉ có một. Sử dụng một phương pháp PCR, Yang et al. – người đầu tiên mô tả đồng nhiễm WSSV-PstDV1 trong tôm thẻ L. vannamei. Xie et al. cũng xác định một trường hợp đồng nhiễm WSSV-PstDV1 trong số 15 loài động vật được sàng lọc bằng cách sử dụng một phương pháp qPCR multiplex. Khảo nghiệm Duplex chuẩn qPCR xác định một tần số nhiễm WSSV-PstDV1 cao hơn so với những báo cáo trong nghiên cứu trước đây, có thể là độ nhạy vượt trội của nó so với các phương pháp mô tả trước đây. Điều này cũng có thể cho thấy rằng tần số đồng nhiễm tự nhiên trong trang trại nuôi tôm Brazil là cao hơn so với các nước khác. Nghiên cứu trước đây chứng minh rằng WSSV và nhiễm trùng PstDV1 xảy ra trên tôm nuôi ở Brazil và các nước khác ở Nam Mỹ. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong tương lai phải được thực hiện để giải quyết các tần số đồng nhiễm WSSV / PstDV1 trong trang trại nuôi tôm ở từng khu vực.
Kết luận
Duplex qPCR là một công cụ chẩn đoán mạnh và có độ nhạy cao để phát hiện đồng thời WSSV và PstDV1 trong tôm chân trắng. Việc sử dụng TUMM và phương pháp ngưỡng tương đối theo phân tích dữ liệu trên WSSV/PstDV1 phương pháp kép qPCR cung cấp mức độ tối ưu của độ nhạy và độ đặc hiệu.
Lợi ích cạnh tranh
Các tác giả tuyên bố rằng họ không có lợi ích cạnh tranh.
Source: Huyền Thoại, Theo Thefishsite.com
Bài viết: TepBac.Com