Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm AHPND hay còn gọi là hội chứng tôm chết sớm EMS thường xuất hiện trên tôm nuôi khoảng 1 tháng tuổi. Bệnh AHPND lần đầu tiên được báo cáo ở Trung Quốc, sau đó lan sang các nước như Việt Nam, Malaysia và Thái Lan.
Bệnh AHPND được xác định là do một loại vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio rất phổ biến và có mặt ở khắp nơi trên thế giới là Vibrio parahaemolyticus (VP) (Tran et al, 2013). Việc xác định vi khuẩn này ở mức độ loài có thể sử dụng phương pháp PCR với các gen mục tiêu là tlh và toxR (Bej et al., 1999; Kim et al., 1999). Trong khi hầu hết các chủng VP không có khả năng gây bệnh, một số dòng gây bệnh viêm dạ dày hay viêm ruột trên người sau khi ăn hải sản nhiễm vi khuẩn VP (Nishibuci and Kaper 1995; Yeung and Boor 2004). Tuy nhiên, các dòng VP gây bệnh trên người không có liên quan đến bệnh AHPND trên tôm (Tran et al, 2013). Hơn nữa, các dòng VP gây bệnh AHPND trên tôm cũng không có khả năng gây bệnh trên người. Trong nghiên cứu này, hai nhóm mồi (primers) là LAMP-A2 và LAMP-A3 được sử dụng để xác định vi khuẩn VP gây bệnh AHPND trên tôm.
Phương pháp nghiên cứu
Vi khuẩn dùng cho nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn dùng rong nghiên cứu này bao gồm V. parahaemolyticus, V. furnissii, V. fluvialis, V. vulnificus, V. mimicus, V. alginolyticus, V. harveyi, V. metschnikovii, V. cholerae, V. campbellii, V. cincinatiensis, V. splendidus, V. gazogenes, V. mytili, Grimontia hollisae, Photobacterium damselae subsp. damselae, Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Escherichia coli, Plesiomonas sp. và Listeriasp. 33 chủng VP gây bệnh AHPND được phân lập từ gan tụy và ruột của tôm bệnh.
Mồi (primer) dùng cho phản ứng LAMP: 6 loại mồi khác nhau mỗi nhóm được sử dụng cho nghiên cứu này (Bảng 1). Nhóm mồi LAMP-A2 được thiết kế dựa trên trình tự 700 bp của gen AP2 (http://www.enaca.org/publications/health/disease-cards/ahpnd-detection-method-announcement.pdf; Joshi et al. 2014) và nhóm mồi LAMP-A3 được thiết kế dựa trên trình tự 336 bp của gen AP3 (http://www.shrimpnews.com/FreeReportsFolder/NewsReportsFolder/ThailandNewPCRDetectionMethodFlegel.ht….
Bảng 1: Trình tự hai nhóm mồi LAMP sử dụng trong nghiên cứu này
Thành phần phản ứng LAMP: Tổng thể tích phản ứng là 25 ul bao gồm 2 ul dịch chiết DNA, 1.6 ul mỗi loại mồi FIP và BIP, 0.8 ul mỗi loại mồi F3 và B3, 0.2 ul mỗi loại mồi LF và LB, 1 ul Bst DNA polymerase (NEB) trong 2 ul dung dịch đệm [0.25 M Tris-HCl pH 8.8, 0.125 M KCl, 0.125 M (NH4)2SO4, 2.5% Tween 20], 16 mM MgSO4, 1.6 M Betaine và 2.8 mM dNTP. Hổn hợp phản ứng được ủ trong Loopamp realtime turbidimeter (Eiken) trong 60 phút ở 65oC và sau đó 2 phút ở 80oC. Phản ứng được xem là dương tính khi độ đục đạt 0.1 trong 60 phút. Sự hiện diện của vi khuẩn VP trong các phản ứng dương tính được tái khẳng định bằng cách sử dụng phản ứng LAMP với gen mục tiêu là tlh được mô tả trước đây (Yamazaki et al. 2008).
Kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu cho thấy, LAMP-A2 và LAMP-A3 có khả năng phát hiện tất cả 33 chủng VP gây bệnh AHPND phân lập được, ngoài trừ chủng VP không gây bệnh AHPND và 19 loài vi khuẩn khác có liên quan tương đồng với chủng vi khuẩn gây bệnh. Ở thí nghiệm trên chủng vi khuẩn thuần (pure culture bacteria) nuôi trên môi trường Luria-Bertani (LB) có bổ sung 1% NaCl và mẫu tôm được nghiền trong dung dịch APW (alkaline peptone water), sau đó ủ với dung dịch vi khuẩn VP đạt đến nồng độ 10-10^5 CFU/ml cho thấy kỹ thuật xét nghiệm LAMP cho kết quả tốt hơn PCR trong việc phát hiện VP gây bệnh AHPND.
Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường thuần, giới hạn phát hiện của LAMP-A3 là 53 CFU/ml hoặc 0,1 CFU/phản ứng (thấp hơn 10 lần LAMP-A2), trong khi ở thí nghiệm mẫu tôm được nghiền trong dung dịch APW (alkaline peptone water), sau đó ủ với dung dịch vi khuẩn VP có giới hạn phát hiện là 4.4 × 10^5 CFU/ml hoặc 8.8 × 10^2 CFU/phản ứng. Kết quả kiểm tra thêm trên 24 mẫu tôm post, tôm trưởng thành, trầm tích (sediment) và nước thu từ một trang trại nuôi tôm cho thấy VP gây bệnh AHPND đã được phát hiện chủ yếu trong các mẫu trầm tích. Kết quả nghiên cứu cho thấy xét nghiệm LAMP dựa trên LAMP-A3 thích hợp hơn trong việc xác định chủng VP gây bệnh AHPND trong nuôi tôm so với LAMP-A2 và PCR.
Triệu Tuấn, trieutuan.blog
Source: Aquaculture International. LAMP Assay to Detect Vibrio Parahaemolyticus Causing Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease in Shrimp. Jetnaphang Kongrueng, Natta Tansila, Pimonsri Mitraparp-arthorn, Mitsuaki Nishibuchi, Gary J. Vora and Varaporn Vuddhakul (emailvaraporn.v@psu.ac.th, Food Safety and Health Research Unit, Department of Microbiology, Faculty of Science, Prince of Songkhla University, Hat Yai, Songkhla, Thailand). January 7, 2015.