Bệnh đốm trắng do vi rút đốm trắng gây ra là một bệnh nguy hiểm trên tôm nuôi và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm.
1. Giới thiệu
Sản lượng tôm toàn cầu có xu hướng giảm từ năm 1994 đến năm 1997. Sản lượng tôm từ 733.000 tấn (1994) đã giảm còn 712.000 tấn (1995) và 693.000 tấn (1997) (Rosenberry, 2013). Sự suy giảm này nguyên nhân chủ yếu là do bệnh đốm trắng gây ra (WSSV). WSSV còn đe dọa đến nhóm tôm, cua nước mặn, lợ và ngọt vì phổ ký chủ của WSSV rất rộng (Wang et al., 1998). Bệnh do vi rút gây ra đã bùng nổ từ năm 1991 trên các khu nuôi tôm công nghiệp, WSSV lần đầu tiên được xác định ở Trung Quốc và Đài Loan vào năm 1991 trên tôm Penaeus japonicus. WSSV lan truyền rộng khắp các khu nuôi tôm công nghiệp Châu Á vào năm 1994 (Rout et al., 2005). WSSV là nguyên nhân gây thiệt hại về kinh tế bởi vì nó gây chết đến 100% từ 3-5 ngày tùy vào điều kiện nuôi (Pradeep et al., 2009). Sự lan truyền WSSV đến tôm nuôi có thể do vài con đường: thông qua vật liệu chuyên chở có mang mầm bệnh, chim di cư có mang mầm bệnh, thông qua sự nhập khẩu các sản phẩm đông lạnh có mang mầm bệnh (Durant et al., 2000; McColl et al., 2004)). Một vài nước phát triển như Mỹ, Nhật, châu Âu và Úc đã nhập khẩu sản phẩm tôm đông lạnh từ các nước khu vực châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Đài Loan, Philippine, Indonesia và một số nước châu Mỹ Latin như Braxin, Mexico và Ecuador (Durant et al., 2000). Nguyên nhân quan trọng là do nước dằn tàu cho tàu hay các sản phẩm thủy sản đông lạnh (Flegel, 2009).
Sản phẩm tôm tươi hay tôm đông lạnh khi nhập vào Úc phải chịu sự kiểm soát ba loại bệnh chính là WSSV, YHV và IHHNV bằng kỹ thuật PCR với độ tin cậy 95% từ tháng 10 năm 2007, lô hàng nào dương tính với vi rút thì chúng sẽ bị phá hủy hay nấu chín tại một cơ sở đã được chấp nhận trước đó (Biosecurity Australia, 2007; Sritunyalucksana et al., 2010).
Thông qua những vấn đề trên, để tìm hiểu về WSSV và phương pháp chẩn đoán WSSV nên chuyên đề này được thực hiện nhằm giúp người đọc hiểu thêm về WSSV.
2. Nội dung
2.1 Các dấu hiệu lâm sàng và sự biểu hiện bệnh vi rút đốm trắng
WSSV xâm nhập vào vật chủ và chúng phải mất một thời gian thì mới biểu hiện bệnh, động vật nhiễm bệnh trong vòng 3-8 ngày đẫn đến tỷ lệ chết cao (Corbel et al., 2001). Tôm trước khi có dấu hiệu bệnh WSSV thường bơi gần bờ trước đó 1-2 ngày, tỷ lệ chết có thể đạt 100% sau 10 ngày phát bệnh (Karunasagar et al., 2007; Lotz và Soto, 2002) . Trong ao nuôi tôm, tất cả các kích cỡ hay giai đoạn tôm đều dễ nhiễm bệnh WSSV, nhưng tỷ lệ phát bệnh diễn ra mạnh nhất từ giai đoạn tôm 1-2 tháng tuổi sau khi thả nuôi (Kasornchandra et al., 1998). Triệu chứng rõ ràng nhất của bệnh WSSV là xuất hiện các đốm trắng tròn có đường kính 0,5-3 mm trên lớp biểu mô phần giáp đầu ngực và một phần ở đuôi (Lo et al., 1996). Mặc dù cơ chế chính xác của sự hình thành các đốm trắng chưa được rõ nhưng có thể giải thích là do ký chủ bị rối loạn chức năng của lớp biểu bì nên dẫn đến sự tích tụ các hạt canxi màu trắng bên dưới lớp biểu bì làm phát sinh các đốm trắng (Wang et al., 1999). Một số biểu hiện khác của bệnh này là sự rối loạn tế bào sắc tố đỏ trên cơ thể và các phụ bộ do sự lan truyền của tế bòa sắc tố (Lightner et al., 1998; Nadala et al., 1998), tôm giảm ăn, tôm nhợt nhạt, phản ứng chậm chạp, lớp biểu bì không chặt chẽ, khả năng đông máu giảm. Về mặt mô học, đặc điểm của sự nhiễm WSSV là các tế bào eosinophil và basophil tăng lên, chúng có dạng hình tròn hay trái xoan trong nhân của những tế bào bị nhiễm. Những nhân bị nhiễm sẽ to lớn và rộng hơn, ở giai đoạn nhiễm cuối thì có sự phân rã nhân tế bào và tế bào có thể sẽ bị phân rã đẫn đến các vùng hoại tử đặc trưng.
2.2 Sự tồn tại và tính ổn định của WSSV
WSSV có thể tồn tại đến 30 ngày trong nước biển dưới điều kiện phòng thí nghiệm ở 30 oC và tồn tại ít nhất 3-4 ngày trong ao. WSSV bị bất hoạt ở 50 oC dưới 120 phút và 60 oC dưới 1 phút. Theo Maeda et al.(1998) PRDV của WSSV bị bất hoạt bởi NaCl 1ppm trong 30 phút và ở 5 ppm trong 10 phút, còn SEMBV ở 10 ppm trong 30 phút, Povidone-iodine bất hoạt các vi rút ở 10 ppm trong 30 phút. Ở nồng độ NaCl cao (12,5%) PRDV sẽ bị bất hoạt trong 24h ở 25 oC và các SEMBV bị bất hoạt trong 24h ở 28 oC, PRDV được bất hoạt bằng cách đun ở 50 oC trong 20 phút, bằng cách sấy khô ở 30 oC trong 1h hay trong Ethyl ether ở 4 oC trong 18h. Các PRDV tồn tại trong nước biển ít nhất 120 ngày ở 4 oC hay nhiều hơn 60 ngày nhưng ít hơn 120 ngày khi giữ ở 25 oC, theo Reddy et al. (2011), có nhiều phương pháp xử lý khác nhau như: đóng băng, nấu chín, đóng băng nhanh và nấu chín, đóng băng chậm và nấu chín hay lưu trữ ở nhiệt độ lạnh để phá hủy ADN của WSSV, nhưng phương pháp hiệu quả nhất là đóng băng nhanh và nấu chín.
2.3 Bộ gene của WSSV
Bộ gen WSSV là một phân tử dsADN dạng tròn và là một trong những bộ gen vi rút động vật lớn nhất đã được giải trình tự hoàn chỉnh. Kích thước bộ gen thay đổi tùy theo các chủng vi rút. Có 3 trình tự WSSV hoàn chỉnh có ký hiệu là AF369029, AF332093, AF440570 và kích thước của bộ gen được tìm thấy là 292.967 bp, 305.107 bp, 307.287 bp lần lượt được xác định ở Thái Lan, Trung Quốc và Đài Loan. Phân tích trình tự nucleic cho thấy bộ gen của WSSV mã hóa khoảng 185 ORFs của 50 loại acid amin hay nhiều hơn thế. Với trình tự ADN của WSSV đã được giải hoàn chỉnh cho thấy các nghiên cứu đã được tập trung vào việc phân tích chức năng của gen, đặc biệt là về chức năng của các protein vỏ vi rút. Một vài gen cấu trúc và gen chuyển hóa ADN có liên quan cũng được xác định.
2.4 Protein của vi rút (Virion proteins)
Một virion được lắp ráp từ các đại phân tử phức tạp để phù hợp cho sự bảo vệ và tạo nên bộ gen cho vi rút. Protein cấu trúc của nó có tính chất rất quan trọng, đây là những protein đầu tiên tiếp xúc với vật chủ, đo đó nó có vai trò quan trọn trong tế bào mục tiêu cũng như sự huy động tự vệ của vật chủ, các đặc tính của protein cấu trúc và trình tự gen của nó có vai trò quan trọng trong sự xác định vị trí phân loại của vi rút, thêm vào đó, cấu trúc và sựu tương tác của virion WSSV có thể giải thích được sự hình thành cấu trúc hình thái tinh xảo cảu vi rút. Sự xét nghiệm chẩn đoán có thể dựa trên một hay nhiều protein cấu trúc của vi rút, WSSV có một số protein đặc trưng, một số protien không cấu trúc tham gia vào quá trình phiên mã (VP9), sự phát triển của vi rút (WSV 021) và điều chỉnh sự sao chép cảu ADN (WSV 477), trong tổng số các protein của vi rút được tìm thấy đã có 21 protein nằm trong màng bao, 10 protein nằm trong nuclecapsid và 5 nằm trong vỏ (cấu trúc giả định nằm giữa màng bao và nuclecapsid).
Các protein không cấu trúc được tìm thấy trong bộ gen của WSSV cho thấy chúng cần thiết cho sự sao chép của bộ gen vi rút, sản sinh các hạt vi rút và ức chế chức náng của tế bào. Do đó, những protein này có tiềm năng trong quá trình sản xuất thuốc và sự phát triển vắc-xin vi rút, VP9 là một loại protein có chiều dài đầy đủ được mã hóa bởi ORF115 được xác định lần đầu tiên trên mô tôm Sú bị nhiễm bệnh với các mẫu mang, dạ dày, protein không cấu trúc bởi phương pháp Western blott. Mặc dù chức năng của VP9 chưa được hiểu rõ ràng, có nhiều nghiên cứu cho thấy VP9 như là một loại protein có trong WSSV trong mô của vật chủ bị nhiễm bệnh, nghiên cứu chiếu xạ tia X và những nghiên cứu cơ bản về cấu trúc cho thấy VP9 có chứa ADN được bao bọc bởi những ion Zn ở những vị trí liên kết đặc biệt. Tất cả các nghiên cứu cho thấy VP9 có chức năng điều chỉnh quá trình phiên mã của WSSV.
Protein vỏ đặc biệt quan trọng cho sự bao bọc lấy vi rút, chúng đóng vai trò quan trọng cho sự xâm nhập của vi rút, sự lắp ráp và sự hình thành vi rút mới, protein vỏ VP31, VP110, VP281 có chứa một tế bào và tế bào này có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của vi rút, các protein vỏ VP36A, protein nucleocapsid VP664 và VP136A cũng có một tế bào đặc trưng đính kèm, những protein khac như VP28, VP39B, VP31A, VP41B, VP51A, VP51B, VP68, VP124, VP150, VP187, VP281, VP292 và collagen giống protein cũng có một vị trí đặc trưng trong lớp vỏ vi rút, trong khi đó các protein VP35, VP466, VP15, VP51 và VP76 đã được tìm thấy trong nuclecapsid và có nững chức năng khác nhau.
Trong số những protein thì VP466 có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của vi rút. P466 là gen được thiết kế bởi ORF151 và là gen phụ trợ tiềm ẩn của WSSV có chức năng như một enzyme thúc đẩy sự tổng hợp protein.
2.5 Sự định danh WSSV bằng PCR
Hiện nay có rất nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau để xác định được WSSV, chúng bao gồm kỹ thuật mô bệnh học, lai tại chỗ, phương pháp miễn dịch học như Nitrocellose-enzyme immunoblot, Western blot techniques và nhiều phương pháp gần đây rất đơn giản, độ nhạy cao và độ tin cậy cao như kỹ thuật PCR cơ bản, mức độ nhyaj cảm của phương pháp ở những mẫu ADN khác nhau thì khác nhau, điều này được tìm thấy trong các nghiên cứu gần đây về việc xác định các gen tiềm ẩn của WSSV bằng các gen chip. Tuy nhiên, từ thực tế cho thấy trong các kỹ thuật chẩn đoán khác nhau thì chỉ có PCR là cho độ nhạy và tính đặc hiệu cao trong việc xác định WSSV. PCR được ứng dụng để xác định WSSV mootjcacs cụ thể và nhạy, PCR tổ hay PCR 2 bước có độ nhạy cao hơn PCR một bước.
Khi tôm có dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng thì dễ dàng để xác định được WSSV bằng PCR một bước, tuy nhiên, với lượng vi rút thấp hay vi rút tiềm ẩn chưa gây hại cho tôm thì cần dùng PCR tổ. Một số tác giả sử dụng sự phiên mã ngược trong PCR để xác định WSSV. Durand và Lightner đã phát triển PCR định lượng thời gian thật để phát hiện và định lượng WSSV trong những mẫu tôm có chứa WSSV.
2.6 Thiết kế mồi cho PCR xác định WSSV
Đã có một số đoạn mồi đã được thiết kế bởi nhiều nhóm nghiên cứu để thực hiện kỹ thuật PCR trong việc xác định WSSV. Lo et al. (1996) đã thiết kế 3 bộ mồi dựa trên trình tự của đoạn ADN Sal I 1461 bp của WSSV. Cặp mồi 146F1/146R1 cho đoạn ADN 1447 bp, trong khi cặp mồi 146F2/146R2 vại 146F4 / 146R3 cho đoạn 941 và 775 bp. Một tập hợp các đoạn mồi được thiết kế bởi Wongteerasupaya et al. (1995), dựa trên trình tự của 294 đoạn ADN đặc biệt của WSSV. Takahashi et al. (2000), đã thiết kế một cặp mồi để khuếch đại đoạn 643 bp đó là mồi PJ1 và PJ2. Kim et al. (1998) đã thiết kế cặp mồi IF và IR dựa trên trình tự ADN của WSSV để khuếch đại đoạn 365 bp.
3. Kết luận
Qua đây cho thấy ADN của WSSV không bị phá hủy bởi sự đóng băng, làm lạnh, nấu chín và sau đó đóng băng chậm, đóng hộp, và các quá trình bảo quản lạnh. PCR tổ là kỹ thuật đáng tin cậy nhất để phát hiện ADN WSSV từ các sản phẩm tôm. ADN WSSV có thể bị phá hủy bởi nấu ăn sau quá trình làm lạnh nhanh chóng. Do đó, nguy cơ lây truyền bệnh đốm trắng từ các sản phẩm tôm bị nhiễm bệnh với các hệ thống nuôi trồng thủy sản nội địa có thể được giảm bằng cách kết hợp các quá trình nấu chín với đóng băng nhanh chóng, do đó làm giảm nguy cơ thiệt hại kinh tế cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới.
Source: Nguyễn Thành Tâm. Chuyên đề: Kỹ thuật PCR trong chuẩn đoán bệnh vi rút đốm trắng.