Nghiên cứu sử dụng protein VP28 là protein thuộc vỏ của vi rút WSSV làm kháng nguyên gây miễn dịch.
1. Giới thiệu
Ngành thủy sản Việt Nam đã và đang trở thành một ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Trong đó, ngành tôm đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều tỉnh khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và khu vực phía Bắc của nước ta. Tuy nhiên, bệnh đốm trắng trên tôm Sú đã gây ra thiệt hại hàng loạt, khi tôm mắc chứng bệnh này thì tỷ lệ gây chết cao (>80%). Vi rút gây bệnh đốm trắng có kích thước 70 – 150 nm x 180 – 250 nm. Vi rút này có AND sợi kép, chiều dài AND gần bằng 290 Kb. Virion của vi rút đốm trắng được tách từ tôm nhiễm bệnh chứa 5 protein chính: VP26, VP24 và VP15 kết hợp với vỏ nhân, VP28 và VP19 thuộc vỏ của vi rút (Tsai et al., 2004 và Hội et al., 2000). Để phát hiện được mầm bệnh trên tôm do các loại vi rút gây ra, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử và các kỹ thuật của sinh học phân tử như: PCR 2 bước, RT-PCR đã được thực hiện bởi Đinh Thương Vân và ctv. (1999), Lightner (1996) và Takahashi et al. (2003). Tuy nhiên, những kỹ thuật này còn một số hạn chế như khó có thể phát hiện được các chủng khác nhau của một số loại vi rút hoặc chỉ có thể thực hiện ở các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện đại, chưa thể ứng dụng rộng rãi và trực tiếp tại các nông trại nuôi tôm để giúp người nuôi phát hiện sớm, chính xác bệnh và để phòng tránh lay lan dịch bệnh. Hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng để tạo các que thử phát hiện nhanh, nhiều loại bệnh trên cả con người và động vật nhờ vào tính đặc hiệu và độ nhạy rất cao của kháng thể đơn dòng (Brich và Lennox, 1995; Celis et al., 1994; Kohler và Milstenin, 1975; Me và Speir, 1996). Nhật Bản và Thái Lan đã sản xuất thành công que thử nhanh sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện sớm vi rút gây bệnh đốm trắng trên tôm (Sithigorngul et al., 2000; Takahashi et al., 2003).
Nghiên cứu sử dụng protein VP28 là protein thuộc vỏ của vi rút WSSV làm kháng nguyên gây miễn dịch. VP28 đã được tách dòng, biểu hiện và tinh sạch để sử dụng làm kháng nguyên trong quá trình tạo kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện sớm bệnh đốm trắng trên tôm (Ha Thi Thu el al., 2007; Phan Thi Phuong Trang et al., 2003). Những nghiên cứu của họ đã tạo được những dòng tế bào hydrodina lai giữa tế bào lympo B tách từ lách chuột BALb/c và tế bào myeloma Sp2/0-Ag14 sản xuất kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu protein VP28 của vi tút gây bệnh đốm trắng trên tôm.
2. Phương pháp nuôi cấy tề bào Sp2/0-Ag14 in vitro
Tế bào Sp2/0-Ag14 do Pezzuto thuộc trường Đại học Hawaii, Hoa Kỳ nghiên cứu và cung cấp cho nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước. Nhiều nghiên cứu đã nuôi tế bào này dưới dạng hỗn hợp dịch trong môi trường nuôi cấy RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 1% PSF, 10% Sodium pyruvat (GIBCO cat. 11874). Tế bào này sẽ được cấy truyền sau 3 – 5 ngày với tỷ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
3. Phương pháp gây miễn dịch
Chuột BALb/c cái khỏe mạnh, có tuổi nuôi từ 6 -8 tuổi được gây miễn dịch với kháng nguyên protein VP28 (Ha Thi Thu et al., 2007). Kháng nguyên có nồng độ 0,05 mg/ml được trộn đều với tá chất CFA (Completed Freund’s adjuvant) theo tỷ lệ 1:1 cho lần tiêm đầu và với tá dược IFA (Incompleted Freund’s adjuvant) theo tỷ lệ 1:1 cho lần tiêm nhắc lại. Kháng nguyên khi được tiêm hóa chất sẽ được tiêm dưới da của chuột. Lần tiêm nhắc lại được thực hiện vào 3 – 4 tuần sau lần tiêm đầu. Lần tiêm cuối cùng cho chuột được thực hiện trước 3 ngày sau khi thí nghiệm lấy tế bào lympo B.
4. Phương pháp lai tế bào tách dòng
Lách chuột được lấy khỏi cơ thể chuột và được tách rời từng tế bào Liddell và Cryer, 1993), hỗn hợp này được rửa sạch bằng PBS và đem lai với tế bào Sp2/0-Ag14 với tỷ lệ 1:10 trong điều kiện tách động của 40% polyethylene glycerol (PEG, MW-1500, Sigma), tỷ lệ 1:2 trong 1 phút, tiếp tục thêm 20 ml môi trường RPMI-1640 để rửa, Sau quá trình rửa để loại bỏ PEG, tế bào được bổ sung môi trường Dullbecco Modifile Eagle Medium (DMEM) (GIBCO cat. 1.1995) có bổ sung 10% HAT (GIBCO cat. 11067-030). Sau 7 ngày thu nhận 100 dung dịch nổi từ mỗi giếng nuôi tế bào được kiểm tra sự có mặt của kháng thể đặc hiệu VP28 bằng phương pháp ELISA. Dịch nổi nào có được giá trị OD cao gấp 3 lần so với đối chứng âm được xem là có hoạt tính, hay nói cách khác là có kháng thể kháng VP28 trong dịch nổi tương ứng với sự biểu hiện của tế bào lai và khả năng sản xuất kháng thể kháng VP28. Thu nhận tế bào lai hydrosomas từ các giếng có hoạt động mạnh (OD cao) cấy chuyển sang đĩa 24 giếng có môi trường RPMI-1640 để tiếp tục nuôi cấy. Kiểm tra hoạt tính bằng ELISA để tiến nhành tách dòng. Lựa chọn các giếng có một dòng tế bào, có sinh kháng thể kháng VP28 để nhân nuôi số lượng lớn và từ đó tinh sạch và kiểm tra hiệu giá của kahngs thể đơn dòng thu được.
5. Phương pháp ELISA để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu VP28
Phương pháp ELISA dựa trên quy trình của Liddell và Cryer (1993). Kháng nguyên được pha loãng với nồng độ 250 ng/ml trong Carbonate coating buffer (100 µl/giếng) và ủ 1h ở 37oC, tiếp theo là mẫu ủ được rửa 5 lần bằng Washing buffer (Phosphate-buffer saline-PBS có bổ sung 0,005% Tween 20 và 1% skim milk). Tiếp tục bổ sung 100 µl dịch nổi cần kiểm tra vào từng giếng và ủ 1h ở 37oC. Goat-Antimouse IgG conjugate HRP (horseradish peroxidase) (Promega cat. W4021) được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng VP28. Thêm 100 µl/giếng cơ chất TMB (3,3’, 5,5’-tetramethylbenzidene) và ủ 1h ở 37oC. Sau đó đọc kết quả ELISA ở bước sóng 450 nm.
6. Một số kết quả đạt được
Kết quả ELISA cho thấy lượng kháng thể VP28 trong huyết thanh của chuột 3 cao hơn trong các chuột khác nên chuột 3 được sử dụng để thu nhận tế bào lympho B dùng cho quá trình lai với tế bào Sp2/0-Ag14.
Bảng 1. Hoạt động kháng thể kháng VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên tôm từ kháng huyết thanh của chuột được gây cảm nhiễm
Lai tạo các dòng tế bào hydridonas sản xuất kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên tôm. Sau khi đã sàng lọc bằng môi trường chọn lọc HAT và HT nhóm nghiên cứu đã thu được 198/224 giếng có tế bào lai, hiệu quả lai đạt 88%. Phương pháp ELISA được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu VP28 ở từng giếng, có 45/198 (chiếm tỷ lệ 22,7%) giếng có mặt của kháng thể kháng VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên tôm. Thu các tế bào lai của 5 giếng có OD cao nhất trong 45 giếng dương tính và được làm sạch bằng phương pháp pha loãng tới hạn và chọn lọc bằng phương pháp ELISA. Kết quả thu được 10 dòng ký hiệu từ MCAW1 đến MCAW10 sản sinh kháng thể đơn dòng kháng VP28 tốt nhất tương ứng với giá trị OD cao nhất. Trong đó, nhóm nghiên cứu đã thu được 5 dòng tế bào lai sản sinh nhiều kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu VP28 với giá trị OD cao nhất.
Bảng 2. Hiệu giá kháng thể thu được từ 5 dòng tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng kháng VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên tôm
Những kháng thể đơn dòng được tinh sạch và kiểm tra hiệu giá bằng phương pháp ELISA. Kết quả có 5 dòng tế bào lai hydridonas sản xuất ra kháng thể đơn dòng với số lượng lớn nhất (tương ứng với OD lớn nhất khi kiểm tra bằng phương pháp ELISA). Năm dòng tế bào đó được nhân nuôi in vitro để tạo ra lượng lớn tế bào nhằm tạo nguồn tế bào khối u trên chuột và từ đó thu nhận kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu VP28 với số lượng lớn và lưu giữ bảo quản trong nitrogen lỏng, tinh sạch và thu kháng thể đơn dòng đặc hiệu VP28 từ dịch nổi nuôi cấy bằng ammonium sunfat (Liddell vad Cryer, 1993). Kết quả thu được 5 loại kháng thể đơn dòng có hiệu giá kháng thể lớn nhất. Tuy nhiên, lượng kháng thể đơn dòng chưa cao (54 – 95 µg/l) và hiệu giá kháng thể cao nhất mới chỉ đạt mức 3.500 là do lượng tế bào đưa vào nuôi cấy còn thấp.
7. Kết luận
Qua những nghiên cứu trên cho thấy các tác giả đã thu được 5 dòng tế bào lai hydridomas có khả năng sản sinh kháng thể đơn dòng có chất lượng tốt ở nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch là 0,1 mg/ml. Chúng được lưu giữ trong nitrogen lỏng để bảo quản cho những nghiên cứu khác. Hiệu giá kháng thể đơn dòng tinh sạch thu được từ dịch nổi nuôi cấy 5 dòng tế bào này đạt từ 1.000 – 3.500, trong đó chỉ có một dòng đạt hiệu giá cao nhất. Nhóm nghiên cứu đề xuất cần nuôi một lượng lớn tế bào để thu được những kháng thể đơn dòng cao nhất và cho hiệu giá kháng thể cao nhất.
Source: Nguyễn Thành Tâm. Kỹ Thuật Tế Bào: Sản Xuất Kháng Thể Đơn Dòng Kháng Protêin Vỏ Vp28 Của Vi-Rút Gây Bệnh Đốm Trắng Trên Tôm Sú. Khoa Thủy sản, ĐH. Cần Thơ.