Một nhóm các nhà nghiên cứu ở Thái Lan và Đài Loan, đứng đầu là GS. T.W. Flegel và C.F. Lo đã phát triển phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh gan tụy cấp AHPND/EMS trên tôm. Các thông tin được công bố bao gồm trình tự mồi (primers) và cả qui trình chi tiết cho việc phát hiện mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR.
Ở Thái Lan, nghiên cứu được thực hiện bởi Centex Shrimp; Khoa Sức khỏe Cộng đồng, ĐH. Mahidol và Trung tâm nghiên cứu kinh doanh thủy sản, Khoa Thủy sản, ĐH. Kasetsart. Kể từ năm 2011, nghiên cứu này được tài trợ bởi hàng loạt các tổ chức và công ty khác nhau như Agriculture Research Development Agency, the National Research Council of Thailand, the Thai Commission on Higher Education, Mahidol University, the National Science and Technology Development Agency, the Patani Shrimp Farmers Club, the Surathani Shrimp Farmers Club, the Thai Frozen Foods Association, Charoen Pokphand Group, SyAqua Siam Co. Ltd. và Thai Union Group. Ở Đài Loan, nghiên cứu cũng được hỗ trợ bởi các tổ chức như Taiwan National Science Council, National Cheng Kung University (NCKU), National Taiwan University (NTU) và Unipresident Enterprises Corporation.
Vào ngày 5/12/2013, các nhà nghiên cứu đã có được thông tin so sánh về trình tự di truyền của vi khuẩn gây bệnh EMS và tiến hành các nghiên cứu phương pháp phát hiện tác nhân gây nên EMS bằng kỹ thuật PCR.
Cấu trúc mô gan tụy tôm khỏe (bên trái) và mô gan tụy bị phá hủy bởi AHPND/EMS (bên phải) khi phân tích bằng kỹ thuật mô bệnh học
Thông tin cần thiết cho người sử dụng phương pháp này từ các nhà nghiên cứu
“Chúng tôi tin rằng thời gian mỗi ngày để giảm thiệt hại do AHPND/EMS bùng phát ở Thái Lan vượt xa những lợi ích mà chúng tôi thu được từ bản quyền nghiên cứu của chúng tôi…Sự chậm trễ có thể kéo dài đến vài tuần hoặc vài tháng để chuẩn bị các giấy tờ, thủ tục cho bằng sáng chế, xin giấy phép và chuẩn bị đưa ra thị trường bộ test kit chuẩn đoán bệnh… Bên cạnh đó, bản chất phức tạp của các nguồn tài trợ cho nghiên cứu cũng là điều đáng lo ngại như tỷ lệ tiền bản quyền giữa các nhà tài trợ,…Chúng ta không thể biện minh cho những tổn thất kinh tế có thể có do sự chậm trễ dù chỉ vài ngày hoặc vài tuần hoặc vài tháng.
Vì những lý dó đó, chúng tôi quyết định cung cấp miễn phí thông tin chi tiết kết quả nghiên cứu của chúng tôi về trình tự gen và qui trình phát hiện tác nhân gây bệnh AHPND/EMS bằng kỹ thuật PCR. Điều này cho phép phổ biến rộng rãi và nhanh chóng đến các bên liên quan đến ngành công nghiệp nuôi tôm để có thể làm giảm nguy cơ bùng phát dịch bệnh AHPND/EMS.
Mặc dù chúng tôi đã thử nghiệm phương pháp chuyên biệt dành cho vi khuẩn gây bệnh AHPND, nhưng số lượng mẫu vẫn còn tương đối nhỏ. Một cách tổng quát, chúng tôi nhận thấy rằng:
1. Hai cặp mồi cho phản ứng PCR cho kết quả dương tính (+) và âm tính (-) như nhau trong tổng số 67/68 mẫu kiểm tra. Chỉ một trường hợp ngoại lệ là cặp mồi AP1 cho kết quả dương tính, nhưng lại âm tính với cặp mồi AP2.
2. Trong số 14 mẫu mô gan tụy (10 con tôm từ mỗi ao) từ một nghiên cứu của FAO tại Việt Nam sử dụng cho phân tích metagenomics, 8 mẫu dương tính với AHPND khi phân tích bằng phương pháp mô bệnh học cho kết quả 5 mẫu dương tính và 3 mẫu âm tính khi dùng cả hai cặp mồi AP1 và AP2 trong phản ứng PCR. Trong khi đó, 5 mẫu âm tính với phương pháp mô bệnh học cũng đồng thời cho kết quả âm tính khi phân tích bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi AP1 và AP2.
3. Trong 68 mẫu tôm chạy thử nghiệm, phân lập được 5 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và đã được chứng minh là tác nhân gây bệnh AHPND/EMS bằng phân tích mô bệnh học. Tất cả đều cho kết quả dương tính với 2 cặp mồi AP1 & AP2, trong khi 3 mẫu vi khuẩn phân lập từ bùn đáy ao tôm từ năm 2002 và đã thử nghiệm xác định chúng không có khả năng gây bệnh AHPND hoặc không gây chết tôm khi gây cảm nhiễm đều cho kết quả âm tính với cả hai cặp mồi.
4. Một mẫu vi khuẩn phân lập được không xác định có AHPND khi phân tích mô bệnh học, nhưng gây tỷ lệ tôm chết rất cao với những dấu hiệu bất thường trên mô gan tụy cho kết quả dương tính với cả hai cặp mồi.
5. Những mẫu vi khuẩn phân lập được như Shewanella, Rhodococcus, Leifsonia, Delftia, Ralstonia, V. vulnificus, V. harveyi, V. alginolyticus và B. subtilis cho kết quả âm tính với cả hai cặp mồi.
Do đó, chúng tôi không đảm bảo rằng phương pháp chuẩn đoán theo mô tả không có phản ứng chéo với các vi khuẩn không gây AHPND/EMS hoặc với bất kỳ sinh vật nào khác.
Chúng tôi cũng không thể đảm bảo rằng phương pháp này sẽ phát hiện thành công tất cả các chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh AHPND. Chúng tôi xin mời tất cả các bên liên quan giúp chúng tôi phát triển tiếp phương pháp phát hiện bệnh AHPND/EMS mới.
Các phân tích, so sánh về trình tự gen cho thấy trình tự mục tiêu mà chúng tôi xác định có nguồn gốc từ plasmid DNA và không phải từ DNA nhiễm sắc thể của tác nhân gây bệnh AHPND. Nếu giả định này được xác nhận, nó sẽ có những tác động liên quan đến cơ chế truyền độc tính. Ví dụ như, AHPND được công bố bởi Loc Tran và những nhà nghiên cứu khác cho thấy nó gây nên bởi độc tố của vi khuẩn, và độc tố vi khuẩn có thể mã hóa cho protein bởi plasmid DNA của trình tự mục tiêu mà chúng tôi dùng trong phương pháp PCR. Tuy nhiên, phương pháp PCR để phát hiện tốt nhất phải bao gồm trình tự DNA mã hóa cho gen qui định độc tố do trình tự liên quan đến plasmid có thể thay đổi và không phải tất cả các chủng đều mang gen độc tố. Tuy nhiên, thời gian cần thiết cho nghiên cứu xác định độc tố là không thể đoán trước. Do tình hình khẩn cấp, chúng tôi đã quyết định công bố thông tin sơ bộ này với hy vọng rằng nó sẽ cung cấp một công cụ phát hiện bệnh sớm cho đến khi gen qui định độc tố được xác định.
Chúng tôi hy vọng rằng với phương pháp phát hiện AHPND/EMS này sẽ hỗ trợ tích cực trong việc nghiên cứu cơ chế lây truyền và các biện pháp kiểm soát đối với AHPND/EMS.
Chúng tôi vô cùng biết ơn nếu những người sử dụng các cặp mồi cho phản ứng PCR thông báo cho chung tôi biết về hiệu quả hoặc các vấn đề gặp phải trong khi sử dụng chúng.”
Qui trình PCR chi tiết phát hiện bệnh AHPND/EMS trên tôm
“Ngoài các phương pháp mô tả chi tiết dưới đây, các phương pháp đã được thử nghiệm để khuếch đại trực tiếp đoạn trình tự mục tiêu ngắn hơn 700 bp cũng được thực hiện. Tuy nhiên, những phương pháp đó thường cho kết quả dương tính giả (false possitive) do đó những điều chỉnh trong qui trình so với phương pháp bên dưới là không được khuyến cáo. Tất cả hai cặp mồi AP1 & AP2 đều cho sản phẩm khuếch đại khoảng 700 bp theo qui trình bên dưới đây.”
1. Ly trích DNA: DNA từ dạ dày hoặc mô gan tụy tôm nhiễm bệnh hoặc từ vi khuẩn phân lập được từ tôm bệnh được ly trích bằng phương pháp ly trích DNA thông thường.
2. Hàm lượng DNA trong 25 µl phản ứng PCR khoảng 0.01-1 ng đối với DNA phân lập từ vi khuẩn hoặc khoảng 10-100 ng DNA tổng số (total DNA) phân lập từ mô tôm bệnh.
3. Trình tự hai cặp mồi AP1 & AP2 và đoạn gen mục tiêu: theo chiều 5’-3’, mồi xuôi (forward, F), mồi ngược (reverse, R)
AP1F: 5’- CCT TGG GTG TGC TTA GAG GAT G -3’
AP1R: 5’- GCA AAC TAT CGC GCA GAA CAC C -3’
AP2F: 5’- TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G -3’
AP2R: 5’- CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G -3’
4. Qui trình PCR:
94°C 5 phút;
25-30 chu kỳ: 94°C, 30 giây; 60°C, 30 giây; 72°C, 60 giây
72°C, 10 phút
5. Điện di: Sản phẩm khuếch đại PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% (2 g garose/100 ml dung dịch đệm), sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide, đọc kết quả dưới đèn UV.
6. Đọc kết quả: Mẫu dương tính với AHPND/EMS xuất hiện vạch có kích thước tương đương 700 bp, trong khi mẫu âm tính không có vạch nào xuất hiện trên gel sau khi điện di và soi dưới đèn UV.
Một số ví dụ về kết quả phân tích PCR với hai cặp mồi AP1 & AP2 với mẫu DNA ly trích từ tôm nhiễm AHPND và tôm khỏe từ ao nuôi tôm tại Việt Nam (BL: Bạc Liêu, CM: Cà Mau), Thái Lan và Trung Quốc
Những ai muốn dùng đối chứng dương khi sử dụng hai cặp mồi AP1 & AP2, có thể liên hệ với chúng tôi để nhận hai plasmid DNA có mang gen trình tự mục tiêu được giữ trên giấy lọc. Mẫu này có thể hòa tan từ giấy lọc và biến nạp (transformation) vào vi khuẩn E. coli để dùng lâu dài.
GHI CHÚ
Chúng tôi không tìm được thông tin chi tiết về nồng độ các hóa chất trong phản ứng PCR được công bố trong nghiên cứu này như dNTP, MgCl2, Taq Polymerase,…Tôi khuyến cáo các bạn nên test thử nồng độ các hóa chất này theo phản ứng PCR tổng quát (general PCR) được áp dụng phổ biến như sau:
– 2.5 ul 10X Hotstart Taq Buffer
– 0.5 ul 10 mM dNTP mix
– 0.15 ul 20 uM Forward Primer
– 0.15 ul 20 uM Reverse Primer
– 1 ul 25 mM MgCl2
– 0.125 ul Taq Polymerase
– 1 ul DNA mẫu ly trích (chú ý hàm lượng DNA để điều chỉnh thể tích mẫu DNA ly trích từ bệnh phẩm, khoảng 0.01-1 ng đối với DNA phân lập từ vi khuẩn hoặc khoảng 10-100 ng DNA tổng số (total DNA) phân lập từ mô tôm bệnh)
– Thêm H2O cho đủ 25 ul thể tích cho một phản ứng.
Mồi cho phản ứng các bạn có thể gửi trình tự đến các công ty công nghệ sinh học họ sẽ tổng hợp mồi cho chúng ta, các hóa chất cũng có thể dễ dàng mua được từ các công ty kinh doanh và dịch vụ công nghệ sinh học.
Triệu Tuấn, trieutuan.blog
Source: Shrimp News International