Kết quả thí nghiệm cho thấy qui trình PCR sử dụng cặp mồi F1/IMOD cho phép phát hiện S. agalactiae từ mẫu cá bệnh thu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và có tính chính xác cao.
1. Giới thiệu
Cá điêu hồng một loài cá lai từ cá rô phi có tốc độ tăng trưởng nhanh, giá trị dinh dưỡng cao tuy nhiên do khả năng kháng bệnh thấp, đồng thời với mật độ nuôi cao nên dẫn đến cá dễ mắc bệnh. Trên cá điêu hồng, bệnh lồi mắt, xuất huyết được xác định là do vi khuẩn Streptococcus agalatiae. Bệnh này đã được ghi nhận gây chết cá ở một số bè nuôi ở An Giang, Tiền Giang và Vĩnh Long. Bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa và các tháng giao mùa với tỉ lệ chết cao, gây thiệt hại nghiêm trọng (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012).
Vi khuẩn S. agalactiae được ghi nhận là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cá nước ngọt và nước mặn, như cá hồi chấm đen, cá rô phi, cá da trơn, cá mú, cá chim trắng (Amal and Zamri-saad., 2011). Brian (2009) đã tiến hành nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn chủ yếu là S. iniae và S. agalactiae thuộc tuýp 1, tuýp 2. Trong đó, S. agalactiae tuýp 2 là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên cá rô phi ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines, Thái Lan) và các nước Mỹ La tinh (Ecuador, Honduras, Mexico và Brazil).
Hiện nay, phương pháp phổ biến dùng để phát hiện vi khuẩn S. agalactiae trên cá bao gồm phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20Strep (BioMerieux) và PCR. Tuy nhiên, các phương pháp sinh hóa cần nhiều thời gian cho phân lập, nuôi cấy và định danh vi khuẩn. Thời gian sử dụng cho các phương pháp này thường kéo dài khoảng 4-5 ngày do vậy không đáp ứng được cho yêu cầu chẩn đoán bệnh hiện nay. Gần đây đã có một số qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae trên cá. Maisak et al. (2008) đã dùng phương pháp PCR để phát hiện và phân biệt vi khuẩn Streptococcus spp, S. iniae và S. agalactiae trên cá rô phi bệnh Streptococcosis. Bên cạnh đó, Channarong et al. (2012) đã thực hiện qui trình duplex PCR để phát hiện S. iniaevà S. agalactiae trên cá rô phi với độ nhạy là 10^6 cfu/g mô cá. Các qui trình PCR này giúp phát hiện sớm, chính xác vi khuẩn gây bệnh, thời gian thực hiện ngắn hơn các phương pháp sinh hóa truyền thống.
Do vậy, nghiên cứu phát triển qui trình PCR phát hiện S. agalactiae trực tiếp trên mô cá điêu hồng là cần thiết nhằm: rút ngắn thời gian phân tích và vẫn giữ khả năng phát hiện bệnh với độ chính xác cao.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu vật dùng cho nghiên cứu bao gồm các nguồn: (i) Chủng vi khuẩn S. agalactiae (SaS, S1, S2, S4, S5),Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Streptococcus iniae và Vibrio harveyi từ bộ sưu tập vi khuẩn của Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ; (ii) Cá điêu hồng có trọng lượng trung bình 500 g/con mua từ chợ ở Thành phố Cần Thơ sử dụng cho nội dung tối ưu qui trình ly trích DNA; (iii) Cá điêu hồng (trọng lượng 15-30 g/con) có dấu hiệu bệnh (xuất huyết, lồi mắt) thu từ Đồng Tháp sử dụng cho nội dung kiểm tra khả năng ứng dụng qui trình.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn: Vi khuẩn S. agalactiae được phục hồi trên môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA) ở nhiệt độ 37oC. Sau 36-48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm gram để kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Sau đó vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB) trong vòng 48 giờ.
Vi khuẩn E. ictaluri, A. hydrophila, S. iniae và V. harveyi được phục hồi trên môi trường Trypticase soy agar (TSA) hoặc TSA bổ sung 1,5% NaCl và ủ ở nhiệt độ 28-30oC.
Ly trích DNA của vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (24 -48 giờ) môi trường BHIB ở nhiệt độ 32oC. Lấy 1,5 ml dung dịch vi khuẩn sau khi nuôi tăng sinh được chuyển sang ống eppendorf mới và cho vào 100 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0). Hỗn hợp đun nóng ở 95oC trong 15 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút để tách DNA và trữ ở -20oC cho đến khi sử dụng (Bartie et al., 2006).
Phương pháp ly trích DNA từ mô thận và não cá – phươ ng pháp I: (Taggart et al., 1992): Qui trình được thực hiện bao gồm các bước: Thận/Não cá được nghiền nhuyễn trong 600 µl dung dịch Lysis buffer (0,5 M NaCl, 0,001 M EDTA, 1% SDS, 0,8% Triton, 0,1 M Tris-HCl), 40 µl SDS 10% và 2,5 µl Proteinase K (40 mg/ml), đảo ống và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 15 phút. Cho vào 2,5 µl Rnase (2 mg/ml), đảo ống và tiếp tục ủ dung dịch ở nhiệt độ 37 oC trong 30 phút. Cho vào 600 µl Chloroform – Isoamyl (24:1), đảo và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Rút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới và thêm 600 µl Phenol – Chloroform – Isoamyl (25:24:1), đảo ngược ống và ly tâm 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC. Lặp lại bước trên 1 lần nữa rồi cho vào 600 µl Isopropanol lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. DNA lắng ở đáy ống, nhẹ nhàng loại bỏ dung dịch phía trên. Cho vào 600 µl cồn 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Nhẹ nhàng loại bỏ cồn phía trên. Lặp lại bước trên 1 lần nữa và loại bỏ cồn thật kỹ. Phơi khô mẫu trong vòng vài giờ ở nhiệt độ phòng. Cho 50 µl TE buffer (10 mM Tris, 1mM EDTA, có pH 7) vào ống eppendorf bảo quản ở -20oC.
Phương pháp ly trích DNA từ mô thận và não cá – phương pháp II: (Monfared et al., 2011): Nghiền nhuyễn mẫu thận/não (150 mg) trong 150 µl PBS. Ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút và lấy dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Thêm vào một lượng PBS bằng với lượng mẫu trong ống eppendorf. Sau đó thêm vào 20 µl Lysozyme (10 mg/ml) và ủ ở 37°C trong 15 phút. Mẫu được ủ trong vòng 4 giờ ở 56°C với Lysis Buffer (50 mM Tris-HCL, 1% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM EDTA, 20 mg/ml proteinase K, pH 8). Cho Phenol vào, trộn mẫu 20 giây, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Cẩn thận rút dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf mới. Cho vào mẫu lượng Phenol: Chloroform (1:1) bằng với lượng mẫu hiện có, vortex ống tube 20 giây, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Cẩn thận rút dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf mới. Cho vào mẫu lượng Chloroform bằng với lượng mẫu hiện có, vortex ống tube 20 giây, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Cẩn thận rút dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf mới. Mẫu được làm sạch trong ethanol lạnh (96°C) với thể tích bằng với lượng mẫu hiện có và ủ ở -20°C trong 20 phút. Sau đó tiếp tục ly tâm 1.300 vòng/phút trong 15 phút. Thêm vào 200 µl cồn 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và nhẹ nhàng rút bỏ phần dịch nổi phía trên ra khỏi ống eppendorf. Mẫu được phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm vào 50 µl nước cất và trữ mẫu ở 4°C cho đến khi phân tích.
Phương pháp ly trích DNA từ mô thận và não cá – phương pháp III: (Buller, 2004 có điều chỉnh): Qui trình được thực hiện bao gồm các bước: nghiền nhuyễn mẫu thận/não trong 100 µl PBS, thêm 10 µl lyzozyme (10mg/ml) và ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó, mẫu được thêm vào 10 µl Chelex -100 resin, ủ mẫu ở 56˚C trong 10 phút. Thêm vào 200 µl Trixton X-100. Ủ 100°C trong 10 phút. Làm lạnh mẫu trong nước đá rồi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút. Rút dịch nổi trữ ở 4˚C.
Phương pháp đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA: Nồng độ DNA của mẫu được xác định bằng máy so màu quang phổ sử dụng bước sóng 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch được đánh giá bằng tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm.
Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae (Channarong et al., 2012) Qui trình PCR phát hiện S. agalactiae sử dụng đoạn mồi F1:5’–AGTTTGATCATGGGTCAG-3’ và IMOD: 5’-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3’. Thành phần hóa chất tham gia phản ứng: 1X Taq buffer với MgCl2; 0,5 mM dNTPs; 0,75U Taq DNA polymerase; 0,4 µM mồi F1; 0,4 µM mồi IMOD; 1 µl DNA ly trích. Điều kiện phản ứng: 95ºC trong 5 phút, tiếp theo 95ºC trong 1 phút, 52ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút chu kỳ này được lặp lại 30 lần, cuối cùng 72ºC trong 7 phút. Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu hiện vạch ở vị trí 220bp.
Xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S. agalactiae: Độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S. agalactiae được thực hiện ở các nồng độ vi khuẩn từ 10^7 xuống 10^2 cfu/0,5g mô thận cá điêu hồng.
Xác định tính chuyên biệt của qui trình PCR phát hiện S. agalactiae: Tính chuyên biệt của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae được thực hiện với các loài vi khuẩn thường được phát hiện trong các loài nuôi thủy sản như: Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Streptococcus iniae và Vibrio harveyi.
Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae: Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình ở bốn mẫu vi khuẩn S. agalactiae thu ở các địa điểm khác nhau. Đồng thời ứng dụng qui trình trên bốn mẫu cá (cá bệnh có dấu hiệu bệnh lý như lồi mắt, xuất huyết trên thân, mang,…) để xác định khả năng ứng dụng của qui trình.
3. Kết quả và thảo luận
3.1 Ly trích DNA từ mô thận và não cá điêu hồng
Tổng số 26 mẫu cá điêu hồng có trọng lượng trung bình khoảng 500 g được phân tích để xác định khả năng ứng dụng của các qui trình tách chiết DNA trực tiếp từ mô cá. Thận và não cá sau khi ly trích bằng phương pháp I, II, III được xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA chiết tách.
Qua kết quả từ Bảng 1 cho thấy hàm lượng DNA và độ tinh sạch của phương pháp I, III tốt hơn so với phương pháp II. Ngoài ra, với kết quả điện di gel 2% cho thấy: (i) Phương pháp chiết tách I cho kết quả chiết tách với tổng số 46/52 mẫu đạt và phương pháp III cho 48/52 mẫu đạt, hai phương pháp cho kết quả tương đương nhau. (ii) Trong khi đó, phương pháp II không cho kết quả chiết tách được DNA chỉ với 2 mẫu đạt trong tổng số 52 mẫu chiết tách. Do vậy, phương pháp ly trích DNA I và III được chọn để so sánh khả năng ly trích DNA từ hai cơ quan thận và não cá điêu hồng.
Qua kết quả điện di Hình 1 cho thấy, cả hai phương pháp chiết tách đều cho kết quả ở mô não tốt hơn ở mô thận. Phương pháp chiết tách I có hiện vạch DNA nhưng vẫn còn chứa sản phẩm thừa. Phương pháp III cho kết quả chiết tách được DNA có kích thước lớn, không chứa sản phẩm thừa và thời gian hoàn thành một mẫu chiết tách DNA nhanh hơn. Tuy nhiên, tùy vào điều kiện hóa chất hiện có mà có thể lựa chọn một trong hai phương pháp chiết tách DNA này cho phù hợp.
3.2 Qui trình PCR phát hiện S. agalactiae
Qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae được thực hiện với cặp mồi F1/IMOD với qui trình đã trình bày ở mục 2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện S. agalactiae khi sử dụng cặp mồi F1/IMOD thể hiện qua Hình 2.
Kết quả điện di sản phẩm PCR hiện vạch DNA đặc hiệu của vi khuẩn S. agalactiae ở vị trí 220 bp với cặp mồi F1/IMOD. Tuy nhiên, vạch sản phẩm điện di vẫn còn mờ nên cần thực hiện điều chỉnh tối ưu thêm để đạt được kết quả khuếch đại tốt hơn. Do đó, qui trình tiếp tục được điều chỉnh tối ưu phản ứng PCR phát hiệnS.agalactiae.
Tối ưu thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. agalactiae
Kết quả điện di Hình 3 cho thấy thành phần và điều kiện chu kỳ phản ứng PCR trình bày mục 2.2 không có sản phẩm không đặc hiệu, vạch sản phẩm đúng nhưng không rõ do đó tiến hành tối ưu qui trình phản ứng bao gồm: (i) tăng nồng độ mồi (5pmol lên 10pmol/phản ứng), (ii) tăng nồng độ Taq (0,75U lên 1 U/phản ứng), (iii) khảo sát nhiệt độ gắn mồi (60oC, 59oC, 58,3oC, 56,4oC, 53,4oC, 52,1oC, 50,3oC, 50oC), (iv) tăng chu kỳ phản ứng (30 lên 35 chu kỳ). Như vậy, khi tiến hành thay đổi tăng nồng độ mồi, tăng nồng độ Taq, tăng nhiệt độ gắn mồi 58oC, tăng chu kỳ phản ứng so với ban đầu thì vạch sản phẩm PCR hiện ra rất rõ nét và không có sản phẩm không đặc hiệu. Kết quả điện di Hình 3 cho thấy phản ứng PCR chịu ảnh hưởng bởi các thành phần tham gia phản ứng.
Theo Quyền Đình Thi và ctv. (2008) hàm lượng mồi, hàm lượng Taq thấp có thể là nguyên nhân dẫn đến quá trình khuếch đại không đủ tạo ra sản phẩm. Ngoài ra, nhiệt độ gắn mồi thấp dẫn đến khuếch đại sản phẩm không đặc hiệu ngược lại nhiệt độ gắn mồi quá cao thì có ít sản phẩm được tạo ra. Số chu kỳ của phản ứng tỉ lệ thuận với số lượng bản sao DNA tạo ra và tăng sự rõ nét của vạch sản phẩm điện di.
3.3 Tính đặc hiệu, độ nhạy của qui trình PCR và khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn Streptococus agalactiae
Tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S. agalactiae được thực hiện với các chủng vi khuẩn E. ictaluri, A. hydrophila, S. iniae và V. harveyi. Kết quả điện di xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S. agalactiae thể hiện qua Hình 4A.
Kết quả điện di cho thấy, qui trình khuếch đại chỉ hiện vạch đặc hiệu ở vị trí 220 bp của vi khuẩn S. agalactiaemà không hiện vạch sản phẩm đối với các chủng vi khuẩn khác. Điều này đã xác định được tính đặc hiệu của qui trình khi chỉ phát hiện được vi khuẩn S. agalactiae mà không phát hiện được các loài vi khuẩn khác khi sử dụng mồi F1/IMOD.
Hình 4B cho thấy các vạch sáng mờ dần cùng với sự pha loãng của mật độ vi khuẩn. Ở mật độ vi khuẩn thử nghiệm thấp nhất 10^2 cfu/0,5g mô thận, qui trình vẫn phát hiện và độ sáng của vạch sản phẩm vẫn rõ. Do đó, khả năng phát hiện vi khuẩn của qui trình có thể thấp hơn mức nhiễm 10^2 cfu/0,5g mô cá.
Tiến hành ứng dụng qui trình sau khi đã chuẩn hóa trên 1 số dòng vi khuẩn S. agalactiae để kiểm tra lại khả năng phát hiện S. agalactiae của qui trình (Hình 4C). Qua kết quả điện di cho thấy, tất cả các mẫu đều hiện vạch đặc hiệu 220 bp của S. agalactiae. Đây là các chủng vi khuẩn được phân lập từ bè nuôi cá điêu hồng ở Đồng Tháp, đang bệnh phù mắt xuất huyết. Kết quả Hình 4C đã xác định được khả năng phát hiện chính xác các chủng S. agalactiae của qui trình PCR sau khi được tối ưu hóa.
3.4 Ứng dụng qui trình PCR phát hiện S. agalactiae trên các mẫu cá bệnh
Tiến hành ứng dụng qui trình chiết tách DNA (Buller, 2004) và qui trình PCR sau khi đã chuẩn hóa trên một số mẫu cá điêu hồng để kiểm tra khả năng phát hiện S. agalactiae trực tiếp từ mẫu cá bệnh. Các mẫu cá điêu hồng có các dấu hiệu như xuất huyết, phù mắt (Hình 5).
Mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý được sử dụng để ly trích DNA theo phương pháp của Buller (2004). Kết quả PCR phát hiện trên bốn mẫu cá có biểu hiện bệnh và cho kết quả dương tính (Hình 5) hiện vạch 220 bp. Vậy với qui trình này có thể ứng dụng để xét nghiệm xác định bệnh xuất huyết, phù mắt trên cá điêu hồng với tác nhân S. agalactiae. Đồng thời có thể ứng dụng qui trình kiểm tra chất lượng giống hay kiểm tra tình hình sức khỏe của đàn cá nuôi nhằm ngăn ngừa bệnh một cách hiệu quả.
4. Kết luận
Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể chọn phương pháp ly trích DNA của Buller (2004) hoặc Taggart et al., (1992) từ mô não hoặc mô thận của mẫu cá điêu hồng bệnh. Kết quả ghi nhận qui trình PCR sử dụng cặp mồi F1/IMOD cho phép phát hiện S. agalactiae từ mẫu cá bệnh thu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và có tính chính xác cao. Qui trình rút ngắn được thời gian phân tích và có thể phát hiện vi khuẩn với mật độ thấp nên có ý nghĩa rất lớn trong chẩn đoán bệnh, phục vụ cho các thí nghiệm chuyên sâu nghiên cứu về S. agalactiae.
Development of a PCR procedure for the detection of Streptococcus agalactiae directed in red tilapia tissue
This study was conducted to develop the PCR protocol which detects S. agalactiae from infected fish. The research included: (i) optimization of DNA extraction procedure from fish tissues. The DNA extraction procedure from fish tissues was performed following the methods employed by Taggart et al. (1992), Buller (2004), and Monfared et al. (2011). It was found that the first two methods were better at DNA concentration and the purity of extracted DNA. Besides, DNA that was extracted from brain was better than from kidney; (ii) PCR protocol for the detection of S. agalactiae amplified a specific product of 220 bp. The specific of optimized PCR was tested with some common bacterial isolates in aquaculture such as Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Streptococcus iniae and Vibrio harveyi. The application of this protocol was also examined and positive results were obtained, indicating that the protocol could detect different isolates of S. agalactiae and from red tilapia samples with haemorrhage and exophthalmia in clinical signs.
Source: Trần Thị Tuyết Hoa, Dương Thành Long và Đặng Thị Hoàng Oanh. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 35 (2014): 121-127